2 × Taq Platinum ПТР қоспасы
Белсенділік анықтамасы
1 бірлік (U) Taq Platinum DNA полимеразасының белсенділігі шаблон/праймер ретінде белсендірілген лосось сперматозоидтары ДНҚ көмегімен 30 минут ішінде 74 ° C температурада қышқылда ерімейтін заттарға 10 нмол дезоксинуклеотидтерді енгізу үшін қажет фермент мөлшері ретінде анықталады.
Сапа бақылауы
SDS-PAGE анықтау арқылы тазалық 99%-дан асады; Экзогенді нуклеазаның белсенділігі анықталмайды; Адам геномындағы бір көшірмелі ген тиімді түрде күшейтілуі мүмкін; Бір апта бойы бөлме температурасында сақтау кезінде белсенділіктің өзгеруі болмайды.
Негізгі техникалық параметрлер
Ол 5'-3 ′ экзонуклеаза белсенділігіне және 3′-5 ′ экзонуклеаза белсенділігіне ие және оның сенімділігі Pfu полимеразаның жанында. Taq Platinum Polymerase кеңейту жылдамдығы Pfu полимеразаға қарағанда жылдамырақ және күшейту тиімділігі жоғары. ПТР өнімдерін үшкір ұшына тікелей байланыстыруға немесе TA векторымен клондауға болады. Егер клондаудың тиімділігін арттыру қажет болса, алдымен TA векторына клондау алдында тазартып, 3'-dA асып кетулерді қосу ұсынылады.
Бір құбырлы Taq Platinum MasterMix (Ұлттық жоғары технологиялық өнім сертификаты)
■ Taq Platinum MasterMix ПТР реакциясының спецификасы мен сезімталдығын жақсартты және GC құрамы жоғары, қайталама құрылымы бар ұқсас шаблондарды күшейте алады. Нысаналы шаблонның 2 көшірмесін күшейтуге болады, бұл дәлірек тәжірибелік нәтижелерді қамтамасыз етеді.
■ Бірегей Taq Platinum MasterMix формуласы бүкіл реакция жүйесін өте тұрақты етеді, ал белсенділік қайталанған қату-еру немесе 4 ° C температурада ұзақ сақтау кезінде әсер етпейді.
■ Тұрақты және тиімді алдын ала дайындалған ПТР аралас шешімі жұмысты тез және қарапайым ете алады, бұл еңбек сыйымдылығы мен іріктеу қателігін айтарлықтай төмендетеді. ПТР шарттарына қойылатын талаптарды төмендететін жоғары өнімді ПТР күшейткіші мен оңтайландырушысы да қосылады.
■ Бұл өнімде бояғыштар мен бояусыз жүйелер бар. Бояуы бар MasterMix өнімдері ПТР-дан кейін, жүктеу буферін қоспай, тікелей электрофорланады.
Қолданбалар
Ол геном сияқты күрделі үлгілерден жоғары сенімділік өнімдерін күшейту үшін Pfu полимеразасын алмастыра алады және экспрессия гендерін клондау, сайтқа тән мутациялар және бір нуклеотидті полиморфизмді талдау (SNP) және т.
ПТР праймерін жобалаудағы сақтық шаралары:
Праймердің ұзындығы әдетте 20-25 мерт. ПТР ұзын фрагментті орындау кезінде праймердің ұзындығын 30-35 мерге дейін ұлғайту керек.
■ Екі праймер арасында, әсіресе 3 ′ ұшындағы соңғы 3 негіз үшін, қосымша қосылыс жоқ.
■ GC мазмұны 50-60%болуы керек және жергілікті бай GC немесе AT-тен аулақ болыңыз. Праймер мен шаблонды тұрақты байланыстыру үшін, 3 -ұшындағы AT бай құрылымынан аулақ болыңыз.
■ Қосымша құрылымды қалыптастыру үшін праймерден аулақ болыңыз.
■ Tm температурасы бір -біріне жақын екі праймерді таңдаңыз.
ПТР үшін праймерлердің Tm мәнін есептеу:
■ Праймер 20 мерден төмен болғанда: Tm = 2 ° C × (A+T)+4 ° C × (G+C).
■ Праймер 20 мерден жоғары болғанда: Tm = 81,5+0,41 × (GC%)-600/L, мұндағы L-праймердің ұзындығы.
■ Жылу температурасын (Tm-5) ° C деңгейіне қойыңыз.
ПТР праймерін енгізу
Праймерлердің тиісті соңғы концентрациясын 0,1 мкм мен 1,0 мкм аралығында таңдауға болады. Праймер концентрациясының тым төмен болуы күшейту өнімдерінің төмен шығуына әкеледі, ал тым жоғары праймер концентрациясы спецификалық емес күшейтуге бейім. Әдетте, үлгі ДНҚ мөлшері үлкен немесе күрделі ДНҚ үлгісі (мысалы, адамның геномы ДНҚ) шаблон ретінде пайдаланылғанда, праймер концентрациясы төмен болуы керек. Үлгі ДНҚ мөлшері аз болғанда немесе шаблон ретінде ДНҚ қарапайым үлгісі (мысалы, плазмидті ДНҚ және т.б.) қолданылғанда, праймер концентрациясы жоғары болуы керек.
Барлық өнімдерді ODM/OEM үшін теңшеуге болады. Мәліметтер үшін,Customized Service (ODM/OEM) түймесін басыңыз
  |
1 кб фрагментті күшейту үшін геномдық ДНҚ үлгісін қолданыңыз. ПТР реакциясынан кейін электрофорезді анықтау үшін 5 мкл қабылдайды. |
A-1 үлгісі
■ Үлгі құрамында ақуыз қоспалары немесе Taq ингибиторлары және т.б. бар - ДНҚ үлгісін тазалаңыз, ақуыз қоспаларын алып тастаңыз немесе тазалау жиынтығымен ДНҚ үлгісін шығарыңыз.
■ Үлгінің денатурациясы толық емес - Денатурация температурасын тиісті түрде арттырыңыз және денатурация уақытын ұзартыңыз.
■ Үлгінің нашарлауы —– Үлгіні қайта дайындаңыз.
А-2 праймері
■ Праймерлердің сапасы нашар-праймерді қайта синтездейді.
■ Праймердің деградациясы - консервілеу үшін жоғары концентрациялы праймерлерді шағын көлемге бөліңіз. Бірнеше рет мұздату мен ерітуді болдырмаңыз немесе 4 ° C температурада ұзақ уақыт сақтаңыз.
■ Праймерлердің дұрыс емес дизайны (мысалы, праймердің ұзындығы жеткіліксіз, праймерлер арасында димер пайда болды және т.
A-3 мг2+концентрация
■ Мг2+ концентрациясы тым төмен - Мг -ны біртіндеп жоғарылатады2+ концентрациясы: Mg оңтайландырады2+ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация2+ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.
A-4 Жылу температурасы
■ Жоғары күйдіру температурасы праймер мен шаблонды байланыстыруға әсер етеді. —— Жылу температурасын төмендетіңіз және 2 ° C градиентімен жағдайды оңтайландырыңыз.
A-5 Ұзарту уақыты
■ Қысқа ұзарту уақыты —— Ұзарту уақытын көбейту.
Құбылыстар: Теріс үлгілер сонымен қатар мақсатты реттілік жолақтарын көрсетеді.
А-1 ПТР ластануы
■ Мақсатты тізбектің немесе күшейту өнімдерінің айқас ластануы - теріс үлгідегі мақсатты тізбегі бар үлгіні пипеткамен немесе центрифугалық түтіктен төгіп алмаңыз. Қолданыстағы нуклеин қышқылдарын жою үшін реагенттерді немесе жабдықты автоклавтау керек, ал ластанудың болуын теріс бақылау эксперименттері арқылы анықтау керек.
■ Реагенттердің ластануы - Реагенттерді бөліп, төмен температурада сақтаңыз.
A-2 Primer
■ Мг2+ концентрациясы тым төмен - Мг -ны біртіндеп жоғарылатады2+ концентрациясы: Mg оңтайландырады2+ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация2+ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.
■ Дұрыс емес праймер дизайны және мақсатты тізбектің мақсатсыз реттілікпен гомологиясы бар. —– Қайта жобалау праймері.
Феномендер: ПТР күшейту жолақтары күтілетін мөлшерге сәйкес келмейді, үлкен немесе кіші, немесе кейде спецификалық күшейту жолақтары да, спецификалық емес күшейту жолақтары да кездеседі.
A-1 праймері
■ Праймердің ерекшелігі нашар
—– Қайта жобалау праймері.
■ Праймер концентрациясы тым жоғары —— денатурация температурасын дұрыс жоғарылатыңыз және денатурация уақытын ұзартыңыз.
A-2 мг2+ концентрация
■ Мг2+ концентрация тым жоғары —— Mg2+ концентрациясын дұрыс төмендетіңіз: Mg оңтайландырыңыз2+ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация2+ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.
А-3 термостабильді полимераза
■ Ферменттің шамадан тыс мөлшері - - ферменттің мөлшерін сәйкесінше 0,5 U аралықта азайтыңыз.
A-4 Жылу температурасы
■ Күйдіру температурасы тым төмен ——Жылу температурасын дұрыс арттырыңыз немесе екі сатылы күйдіру әдісін қолданыңыз.
А-5 ПТР циклдары
■ ПТР циклдерінің тым көп болуы - ПТР циклдарының санын азайту.
A-1 праймері—— Нашар ерекшелігі —— Праймерді қайта жобалаңыз, оның ерекшелігін жақсарту үшін оның орнын және ұзындығын өзгертіңіз; немесе кірістірілген ПТР жасаңыз.
A-2 ДНҚ үлгісі
—– Үлгі таза емес - Үлгіні тазартыңыз немесе ДНҚ -ны тазарту жиынтығымен алыңыз.
A-3 мг2+ концентрация
——Мг2+ концентрациясы тым жоғары - Mg мөлшерін дұрыс төмендетеді2+ концентрациясы: Mg оңтайландырады2+ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация2+ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.
A-4 dNTP
——ДНТП концентрациясы тым жоғары —ДНТП концентрациясын тиісінше төмендетіңіз
A-5 Жану температурасы
——Жою температурасы өте төмен ——Жылу температурасын сәйкесінше арттырыңыз
A-6 циклдары
——Онша цикл - Цикл санын оңтайландырыңыз
Бірінші қадам - сәйкес полимеразаны таңдау. Тұрақты Taq полимеразасы 3'-5 'экзонуклеаза белсенділігінің болмауына байланысты тексере алмайды, және сәйкес келмеу фрагменттердің кеңею тиімділігін едәуір төмендетеді. Сондықтан тұрақты Taq полимеразасы 5 кб -тан асатын мақсатты фрагменттерді тиімді түрде күшейте алмайды. Арнайы модификациясы бар так полимеразасы немесе басқа жоғары сенімді полимеразаны кеңейту тиімділігін жоғарылату және үзінділерді ұзақ күшейту қажеттіліктерін қанағаттандыру үшін таңдау керек. Сонымен қатар, ұзын фрагменттерді күшейту сонымен қатар праймердің контурын, денатурация уақытын, ұзарту уақытын, рН буферін және т.б. сәйкес реттеуді талап етеді. Әдетте 18-24 а.к. болатын праймерлер өнімділіктің жоғарылауына әкелуі мүмкін. Шаблонның зақымдалуын болдырмау үшін 94 ° С температурадағы денатурация уақытын циклде 30 сек немесе одан да азайтуға болады, ал күшейту алдында температураны 94 ° C дейін көтеру уақыты 1 минуттан аз болуы керек. Сонымен қатар, ұзарту температурасын шамамен 68 ° C деңгейінде орнату және ұзарту уақытын 1 кб/мин жылдамдығына сәйкес жобалау ұзын фрагменттердің тиімді күшейтілуін қамтамасыз ете алады.
ПТР күшейту қателігі әр түрлі ДНҚ полимеразаларын жоғары сенімділікпен төмендетуге болады. Осы уақытқа дейін табылған барлық Taq ДНҚ полимеразаларының ішінде Pfu ферментінің қателігі ең төмен және сенімділігі жоғары (қосымша кестені қараңыз). Ферментті таңдаудан басқа, зерттеушілер реакция жағдайларын оңтайландыру арқылы ПТР мутация жылдамдығын одан әрі төмендете алады, соның ішінде буферлік құрамын, термостабильді полимеразаның концентрациясын және ПТР циклінің санын оңтайландырады.
Өнімдер санаттары
НЕГЕ БІЗДІ ТАҢДАУ
Біздің фабрика құрылған сәттен бастап принципті сақтай отырып, бірінші әлемдік деңгейдегі өнімдерді шығарады
бірінші кезекте сапа. Біздің өнімдер жаңа және ескі тұтынушылар арасында сенімді беделге ие болды.
- Тел: +86 010-59822688
- 5 ғимарат, No86, Шуангинь батыс жолы, Чанпин ауданы, Пекин.
- people@tiangen.com
