TIANSeq RNA Frag/cDNA синтез модулі

Қазіргі кезде жоғары өткізу қабілеттілігі бар жүйелеу технологиясы негізінен келесі буынның реттілік технологиясына негізделген. Келесі буынның жүйелеу технологиясының оқу ұзақтығы шектеулі болғандықтан, біз толық ұзындық тізбегін шағын фрагментті кітапханаларға бөлуіміз керек. Әр түрлі тізбектеу эксперименттерінің қажеттіліктеріне сәйкес біз әдетте біржақты немесе екіжақты реттілікті таңдаймыз. Қазіргі уақытта келесі буынның дәйектілік кітапханасының ДНҚ фрагменттері әдетте 200-800 а.к. диапазонында таралған.

а) ДНҚ сапасыз және құрамында ингибиторлары бар. Фермент белсенділігін тежемеу үшін жоғары сапалы ДНҚ үлгілерін қолданыңыз.

б) ДНҚ кітапханасын құру үшін ПТРсіз әдісті қолданғанда ДНҚ үлгісі жеткіліксіз. Бөлшектелген ДНҚ-ның енуі 50 нг-тан асқанда, ПТР-сыз жұмыс процесі кітапхананың құрылысы процесінде таңдамалы түрде жүргізілуі мүмкін. Егер кітапхананың көшірме саны тым төмен болса, ДНҚ кітапханасы адаптерді байланыстырудан кейін ПТР көмегімен күшейтілуі мүмкін.

в) РНҚ -ның ластануы ДНҚ -ның бастапқы санының дәл келмеуіне әкеледі РНҚ -ның ластануы геномдық ДНҚ -ны тазарту процесінде болуы мүмкін, бұл ДНҚ -ның дәл санына және кітапхана құрылысы кезінде ДНҚ -ның жеткіліксіз жүктелуіне әкелуі мүмкін. РНҚ -ны RNase көмегімен емдеу арқылы жоюға болады.

A-1

а) Кішкене фрагменттер (60 bp-120 bp) пайда болады Кішкене фрагменттер әдетте адаптер фрагменттері немесе адаптерлерден жасалған димерлер болып табылады. Agencourt AMPure XP магнитті моншақтарымен тазалау бұл адаптер фрагменттерін тиімді түрде жоя алады және реттілік сапасын қамтамасыз етеді.

б) ПТР күшейтуден кейін кітапханада үлкен фрагменттер пайда болады Адаптер байланыстырылғаннан кейін кітапхананың ДНҚ фрагментінің көлемі 120 bp -ге артады. Егер адаптер байланыстырылғаннан кейін ДНҚ фрагменті 120 bp -ден артық жоғарыласа, бұл ПТР шамадан тыс күшеюінің фрагментінің қалыптан тыс күшеюінен болуы мүмкін. ПТР циклдарының санын азайту жағдайдың алдын алады.

в) адаптерді байлаудан кейін кітапхананың ДНҚ фрагменттерінің қалыптан тыс мөлшері Бұл жинақтағы адаптердің ұзындығы 60 а.к. Фрагменттің екі ұшы адаптерлерге байланған кезде, ұзындығы 120 а.к. -ге артады. Осы жинақта ұсынылғаннан басқа адаптерді қолданғанда, адаптердің ұзындығы сияқты тиісті ақпаратты беру үшін жеткізушіге хабарласыңыз. Эксперимент жұмысының және жұмысының нұсқаулықта сипатталған қадамдарды орындауын қамтамасыз етіңіз.

г) адаптер лигировкасына дейінгі ДНҚ фрагментінің қалыпты мөлшері Бұл мәселенің себебі ДНҚ фрагментациясы кезіндегі қате реакция жағдайынан болуы мүмкін. Әр түрлі ДНҚ енгізу үшін әр түрлі реакция уақыттарын қолдану керек. Егер ДНҚ кірісі 10 нг артық болса, біз оңтайландыру үшін бастапқы уақыт ретінде 12 мин реакция уақытын таңдауға кеңес береміз, және осы уақытта шығарылған фрагменттің өлшемі негізінен 300-500 а.к. диапазонында болады. Қолданушылар ДНҚ фрагменттерін қажетті мөлшерде оңтайландыру үшін ДНҚ фрагменттерінің ұзындығын 2-4 минут ішінде ұлғайта немесе азайта алады.

А-2

а) Бөліну уақыты оңтайландырылмаған. Егер фрагменттелген ДНҚ тым кішкентай немесе тым үлкен болса, реакция уақытын анықтау үшін нұсқаулықта берілген үзіліс уақытын таңдау бойынша нұсқаулыққа жүгініңіз және осы уақыт нүктесін бақылау ретінде қолданыңыз. бөлшектеу уақытын дәлірек реттеу үшін реакция жүйесі 3 мин ұзартады немесе қысқарады.

А-3

Фрагментациялық емдеуден кейін ДНҚ мөлшерінің қалыптан тыс таралуы

а) Бөлшектеу реагентінің дұрыс емес еріту әдісі немесе реагент ерігеннен кейін толық араласпайды. Мұзда 5 × фрагментациялы ферменттік микс реагентін ерітіңіз. Еріген соң түтіктің түбін ақырын сипау арқылы реагентті біркелкі араластырыңыз. Реагентті құймаңыз!

б) ДНҚ енгізу үлгісінде EDTA немесе басқа ластаушы заттар бар ДНҚ тазарту сатысында тұз иондары мен хелаттаушы заттардың сарқылуы эксперименттің сәтті болуы үшін өте маңызды. Егер ДНҚ 1 × ТЭ -де еритін болса, фрагментацияны орындау үшін нұсқаулықта берілген әдісті қолданыңыз. Егер ерітіндідегі EDTA концентрациясы белгісіз болса, ДНҚ -ны тазартып, кейінгі реакция үшін оны ионсыздандырылған суда еріту ұсынылады.

в) ДНҚ -ның бастапқы анықталмауы ДНҚ -ның фрагменттелген мөлшері ДНҚ енгізу мөлшерімен тығыз байланысты. Бөлшектеу емделмес бұрын, реакция жүйесінде ДНҚ -ның нақты мөлшерін анықтау үшін Qubit, Picogreen және басқа әдістерді қолдана отырып ДНҚ -ның дәл мөлшерін анықтау қажет.

 г) Реакциялық жүйені дайындау нұсқаулыққа сәйкес келмейді Бөлшектелген реакция жүйесін дайындау нұсқаулыққа сәйкес қатаң түрде мұзда жүргізілуі керек. Жақсы әсер ету үшін реакцияның барлық компоненттерін мұзға қою керек және реакция жүйесін дайындау толық салқындағаннан кейін жүргізілуі керек. Дайындық аяқталғаннан кейін мұқият араластыру үшін сырғытыңыз немесе пипеткамен жағыңыз. Құймаңыз!

1. Дұрыс емес араластыру әдісі (құйын, күшті тербеліс және т.б.) кітапхана фрагменттерінің қалыптан тыс таралуына әкеледі (келесі суретте көрсетілгендей), осылайша кітапхана сапасына әсер етеді. Сондықтан, Fragmentation Mix реакциясының ерітіндісін дайындағанда, араластыру үшін пипеткамен ақырын жоғары қарай жылжытыңыз немесе саусақ ұшымен біркелкі араластырыңыз. Құйындыға араласпау үшін абай болыңыз.

2. Кітапхана құрылысы үшін жоғары тазалықтағы ДНҚ қолданылуы керек

■ ДНҚ -ның тұтастығы: электрофорез диапазоны 30 кб артық, қалдықсыз

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. ДНҚ енгізу мөлшері дәл болуы керек ДНҚ -ны сандық бағалау үшін Nanodrop емес, Qubit және PicoGreen әдістерін қолдану ұсынылады.

4. ДНҚ ерітіндісіндегі EDTA мазмұнын анықтау қажет. EDTA фрагментация реакциясына үлкен әсер етеді. Егер EDTA мазмұны жоғары болса, ДНҚ тазартуды келесі сынаққа дейін жүргізу қажет.

5. Бөлшектеу реакциясының ерітіндісін мұзда дайындау керек Бөлшектеу процесі реакция температурасы мен уақытына сезімтал (әсіресе күшейткішті қосқаннан кейін). Реакция уақытының дәлдігін қамтамасыз ету үшін реакция жүйесін мұзға дайындаңыз.

6. Бөлшектеу реакциясының уақыты дәл болуы керек. Бөлшектеу сатысының реакция уақыты фрагмент өнімдерінің көлеміне тікелей әсер етеді, осылайша кітапханадағы ДНҚ фрагменттерінің мөлшерінің таралуына әсер етеді.

1. Бұл жинаққа қандай үлгі түрі қолданылады?

Бұл жиынтықтың қолданылатын үлгісі жалпы РНҚ немесе жақсы РНҚ тұтастығы бар тазартылған мРНҚ болуы мүмкін. Егер кітапхананы құру үшін жалпы РНҚ пайдаланылса, алдымен рРНҚ -ны жою үшін rRNA -ның сарқылу жинағын (Cat#4992363/4992364/4992391) пайдалану ұсынылады.

2. FFPE үлгілерін осы жинақпен кітапхана құру үшін қолдануға бола ма?

FFPE үлгілеріндегі mRNA белгілі бір дәрежеде нашарлайды, тұтастығы нашар. Бұл жинақты кітапхана құрылысына пайдаланған кезде бөлшектеу уақытын оңтайландыру ұсынылады (бөлшектеу уақытын қысқартады немесе бөлшектеуді орындамайды).

3. Өнім нұсқаулығында берілген өлшемді таңдау қадамын қолдана отырып, енгізілген сегментте аздап ауытқу пайда болуы мүмкін?

Өлшемді таңдау өнім нұсқаулығындағы өлшемді таңдау қадамына қатаң сәйкес жүзеге асырылуы тиіс. Егер ауытқу болса, оның себебі магнитті түйіршіктер бөлме температурасына теңестірілмеген немесе толық араластырылмаған болуы мүмкін, тамшуыр дәл емес немесе сұйықтық ұшында қалуы мүмкін. Тәжірибе үшін адсорбциясы төмен кеңестерді қолдану ұсынылады.

4. Кітапхана құрылысында адаптерлерді таңдау

Кітапхананың құрылыс жинағында адаптер реагенті жоқ, сондықтан оны TIANSeq бір индексті адаптермен (Illumina) бірге қолдану ұсынылады (4992641/4992642/4992378).

5. Кітапхананың СБК

Кітапхананың сандық анықтамасы: Qubit және qPCR кітапхананың массалық концентрациясын және молярлық концентрациясын анықтау үшін қолданылады. Жұмыс қатаң түрде өнім нұсқаулығына сәйкес. Кітапхананың шоғырлануы әдетте NGS реттілігінің талаптарына сәйкес болады. Кітапхананың таралу диапазонын анықтау: Agilent 2100 Bioanalyzer көмегімен кітапхананың таралу диапазонын анықтау.

6. Күшейту циклінің нөмірін таңдау

Нұсқауларға сәйкес, ПТР циклдерінің саны 6-12 құрайды, ал қажет ПТР циклдерінің саны үлгіге сәйкес таңдалуы керек. Рентабельділігі жоғары кітапханаларда шамадан тыс күшейту әдетте әр түрлі дәрежеде болады, бұл Agilent 2100 биоанализаторын анықтауда мақсатты диапазонның шыңынан кейін сәл үлкенірек шыңмен көрінеді немесе Qubit-тің анықталған концентрациясы qPCR-ге қарағанда төмен болады. Кішкене шамадан тыс күшейту - бұл қалыпты құбылыс, ол кітапхананың реттілігіне және кейінгі деректерді талдауға әсер етпейді.

7. Spikes Agilent 2100 Bioanalyzer анықтау профилінде пайда болады

Agilent 2100 биоанализаторын анықтау кезінде шыңдардың пайда болуы үлгілердің біркелкі емес бөлінуіне байланысты болады, онда белгілі бір мөлшерде фрагменттер көп болады және бұл ПТР байытудан кейін айқын болады. Бұл жағдайда өлшемді таңдауды жасамау ұсынылады, яғни фрагменттеу шартын 94 ° С -қа 15 минут инкубациялауға қойыңыз, онда фрагменттің таралуы аз және шоғырланған, және біртектілікті жақсартуға болады.