2 × Пфу ПТР қоспасы

A-1 үлгісі

■ Үлгі құрамында ақуыз қоспалары немесе Taq ингибиторлары және т.б. бар - ДНҚ үлгісін тазалаңыз, ақуыз қоспаларын алып тастаңыз немесе тазалау жиынтығымен ДНҚ үлгісін шығарыңыз.

■ Үлгінің денатурациясы толық емес - Денатурация температурасын тиісті түрде арттырыңыз және денатурация уақытын ұзартыңыз.

■ Үлгінің нашарлауы —– Үлгіні қайта дайындаңыз.

А-2 праймері

■ Праймерлердің сапасы нашар-праймерді қайта синтездейді.

■ Праймердің деградациясы - консервілеу үшін жоғары концентрациялы праймерлерді шағын көлемге бөліңіз. Бірнеше рет мұздату мен ерітуді болдырмаңыз немесе 4 ° C температурада ұзақ уақыт сақтаңыз.

■ Праймерлердің дұрыс емес дизайны (мысалы, праймердің ұзындығы жеткіліксіз, праймерлер арасында димер пайда болды және т.

A-3 мг²⁺концентрация

■ Мг²⁺ концентрациясы тым төмен - Мг -ны біртіндеп жоғарылатады²⁺ концентрациясы: Mg оңтайландырады²⁺ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация²⁺ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.

A-4 Жылу температурасы

■ Жоғары күйдіру температурасы праймер мен шаблонды байланыстыруға әсер етеді. —— Жылу температурасын төмендетіңіз және 2 ° C градиентімен жағдайды оңтайландырыңыз.

A-5 Ұзарту уақыты

■ Қысқа ұзарту уақыты —— Ұзарту уақытын көбейту.

Құбылыстар: Теріс үлгілер сонымен қатар мақсатты реттілік жолақтарын көрсетеді.

А-1 ПТР ластануы

■ Мақсатты тізбектің немесе күшейту өнімдерінің айқас ластануы - теріс үлгідегі мақсатты тізбегі бар үлгіні пипеткамен немесе центрифугалық түтіктен төгіп алмаңыз. Қолданыстағы нуклеин қышқылдарын жою үшін реагенттерді немесе жабдықты автоклавтау керек, ал ластанудың болуын теріс бақылау эксперименттері арқылы анықтау керек.

■ Реагенттердің ластануы - Реагенттерді бөліп, төмен температурада сақтаңыз.

A-2 Primer

■ Мг²⁺ концентрациясы тым төмен - Мг -ны біртіндеп жоғарылатады²⁺ концентрациясы: Mg оңтайландырады²⁺ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация²⁺ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.

■ Дұрыс емес праймер дизайны және мақсатты тізбектің мақсатсыз реттілікпен гомологиясы бар. —– Қайта жобалау праймері.

Феномендер: ПТР күшейту жолақтары күтілетін мөлшерге сәйкес келмейді, үлкен немесе кіші, немесе кейде спецификалық күшейту жолақтары да, спецификалық емес күшейту жолақтары да кездеседі.

A-1 праймері

■ Праймердің ерекшелігі нашар

—– Қайта жобалау праймері.

■ Праймер концентрациясы тым жоғары —— денатурация температурасын дұрыс жоғарылатыңыз және денатурация уақытын ұзартыңыз.

A-2 мг²⁺ концентрация

■ Мг²⁺ концентрация тым жоғары —— Mg2+ концентрациясын дұрыс төмендетіңіз: Mg оңтайландырыңыз²⁺ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация²⁺ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.

А-3 термостабильді полимераза

■ Ферменттің шамадан тыс мөлшері - - ферменттің мөлшерін сәйкесінше 0,5 U аралықта азайтыңыз.

A-4 Жылу температурасы

■ Күйдіру температурасы тым төмен ——Жылу температурасын дұрыс арттырыңыз немесе екі сатылы күйдіру әдісін қолданыңыз.

А-5 ПТР циклдары

■ ПТР циклдерінің тым көп болуы - ПТР циклдарының санын азайту.

A-1 праймері—— Нашар ерекшелігі —— Праймерді қайта жобалаңыз, оның ерекшелігін жақсарту үшін оның орнын және ұзындығын өзгертіңіз; немесе кірістірілген ПТР жасаңыз.

A-2 ДНҚ үлгісі

—– Үлгі таза емес - Үлгіні тазартыңыз немесе ДНҚ -ны тазарту жиынтығымен алыңыз.

A-3 мг²⁺ концентрация

——Мг²⁺ концентрациясы тым жоғары - Mg мөлшерін дұрыс төмендетеді²⁺ концентрациясы: Mg оңтайландырады²⁺ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация²⁺ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.

A-4 dNTP

——ДНТП концентрациясы тым жоғары —ДНТП концентрациясын тиісінше төмендетіңіз

A-5 Жану температурасы

——Жою температурасы өте төмен ——Жылу температурасын сәйкесінше арттырыңыз

A-6 циклдары

——Онша цикл - Цикл санын оңтайландырыңыз

Бірінші қадам - ​​сәйкес полимеразаны таңдау. Тұрақты Taq полимеразасы 3'-5 'экзонуклеаза белсенділігінің болмауына байланысты тексере алмайды, және сәйкес келмеу фрагменттердің кеңею тиімділігін едәуір төмендетеді. Сондықтан тұрақты Taq полимеразасы 5 кб -тан асатын мақсатты фрагменттерді тиімді түрде күшейте алмайды. Арнайы модификациясы бар так полимеразасы немесе басқа жоғары сенімді полимеразаны кеңейту тиімділігін жоғарылату және үзінділерді ұзақ күшейту қажеттіліктерін қанағаттандыру үшін таңдау керек. Сонымен қатар, ұзын фрагменттерді күшейту сонымен қатар праймердің контурын, денатурация уақытын, ұзарту уақытын, рН буферін және т.б. сәйкес реттеуді талап етеді. Әдетте 18-24 а.к. болатын праймерлер өнімділіктің жоғарылауына әкелуі мүмкін. Шаблонның зақымдалуын болдырмау үшін 94 ° С температурадағы денатурация уақытын циклде 30 сек немесе одан да азайтуға болады, ал күшейту алдында температураны 94 ° C дейін көтеру уақыты 1 минуттан аз болуы керек. Сонымен қатар, ұзарту температурасын шамамен 68 ° C деңгейінде орнату және ұзарту уақытын 1 кб/мин жылдамдығына сәйкес жобалау ұзын фрагменттердің тиімді күшейтілуін қамтамасыз ете алады.

ПТР күшейту қателігі әр түрлі ДНҚ полимеразаларын жоғары сенімділікпен төмендетуге болады. Осы уақытқа дейін табылған барлық Taq ДНҚ полимеразаларының ішінде Pfu ферментінің қателігі ең төмен және сенімділігі жоғары (қосымша кестені қараңыз). Ферментті таңдаудан басқа, зерттеушілер реакция жағдайларын оңтайландыру арқылы ПТР мутация жылдамдығын одан әрі төмендете алады, соның ішінде буферлік құрамын, термостабильді полимеразаның концентрациясын және ПТР циклінің санын оңтайландырады.