Тікелей ПТР жиынтығы

Мақсатты генді экстракциясыз шаблон ретінде тікелей қолдана отырып, тез күшейту.

Бұл жинақ адам геномындағы бір көшірмелі гендерді тиімді түрде күшейту үшін гендік инженерияланған ингибиторлық ДНҚ полимеразасын қабылдайды. Бұл жинақтағы жақсы оңтайландырылған буферлік жүйе полимеразаға ПТР ингибиторларының тежелуіне қатты қарсы тұруға көмектеседі, осылайша шаблон ретінде қан мен мәдени жасушаларды қолдана отырып ДНҚ -ны тікелей күшейте алады. Бұл өнімді пайдалану оңай және ДНҚ тазарту немесе сынама алдын ала өңдеу сияқты күрделі қадамдарды қажет етпейді.
Бұл жинақ 2 × MasterMix түрінде ұсынылған және реакцияны қан үлгісін және сәйкес анықтау праймерлерін қосу арқылы жасауға болады. Оны адам, тышқан, шошқа, ірі қара және басқа да түрлер сияқты сүтқоректілердің өсірілген жасушаларына, сондай -ақ жаңа немесе 4 ℃ криоконсервацияланған толық қанға, антикоагулянтқа (EDTA, цитрат, гепарин), сұйылтылған қан ұйығыштары мен құрғақ қан дақтарына қолдануға болады. Whatman 903 және FTA Elute коммерциялық карталарында сақталады.

Мысық Жоқ	Қаптама мөлшері
4992529	20 мкл × 100 айн
4992530	20 мкл × 500 айн

Бізге электрондық хат жіберіңіз

Өнім туралы мәліметтер

Тәжірибелік мысал

Жиі қойылатын сұрақтар

Өнім тегтері

Мүмкіндіктер

■ Қарапайым және жылдам: ПТР -ді үлгіні дайындау мен ДНҚ экстракциясының күрделі қадамдарын қажет етпестен, қанды шаблон ретінде тікелей орындауға болады.
■ Жоғары тазалық: сынамаларды алдын ала өңдеу мен ДНҚ экстракциялау қадамдарын өткізіп жіберу үлгілердің өзара ластануын болдырмауға көмектеседі.
■ Өткізгіштігі жоғары: ПТР-ді ауқымды үлгілерге сәйкестендіру жиынтығын 96/384 ұңғымалы ПТР пластиналарымен біріктіру арқылы жүзеге асырылуы мүмкін.
■ Күшті әмбебаптық: бұл жинақ жоғары GC фрагменттерін немесе күрделі қайталама құрылымы бар фрагменттерді тиімді түрде күшейте алады және күшейту ұзындығы 5 кб дейін болуы мүмкін.
■ Күшті кернеуге төзімділік: Бұл жинақты әр түрлі түрлерде сақталған әр түрлі түрлерге және қан үлгілеріне қолдануға болады.

Қолданбалар

Бұл жиынтықтың ПТР өнімдерінде 3 'ұшында «А» бар, оны ТА векторлық клондау үшін тікелей қолдануға болады. Бұл жинақ геномдық ДНҚ фрагменттерін күшейту, жоғары өткізу қабілетті генетикалық талдау және генотиптерді (мысалы, генді анықтау) талдау үшін қолданыла алады.

Барлық өнімдерді ODM/OEM үшін теңшеуге болады. Мәліметтер үшін,Customized Service (ODM/OEM) түймесін басыңыз

Алдыңғы: TIANcombi DNA Lyse & Det ПТР жинағы

Келесі: Тінтуір тінінің тікелей ПТР жинағы

	Үлгі ретінде адамның EDTA антикоагуляциясын қолдана отырып, GC құрамы әр түрлі 4 ген Blood Direct ПТР жинағы арқылы күшейтілді. ПТР реакция жүйесі 20 мкл болды, ал үлгі ретінде 1 мкл қан қолданылды. М: TIANGEN маркері II; 1: Фрагменттің көлемі 1090 а.к., ГК мазмұны 68,1%; 2: Фрагменттің көлемі 1915 б.п., ГК мазмұны 70,4%; 3: Фрагменттің көлемі 448 а.к., ГК мазмұны 74,8%; 4: Фрагменттің көлемі 1527 bp, GC мазмұны 61,5%. Эксперименттік нәтижелер: Blood Direct ПТР жинағы ДНҚ фрагменттерін ГК құрамы бойынша 61,5%-74,8%аралығында тиімді түрде күшейте алады, бұл оның жоғары ГК фрагменттерін күшейтуге қабілетті екендігін көрсетеді.
	Үлгі ретінде адамның EDTA антикоагуляциясын қолдана отырып, Blood Direct ПТР жиынтығымен әр түрлі ұзындықтағы 5 ген (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 және Hn4.0) күшейтілді. ПТР реакция жүйесі 20 мкл болды, ал үлгі ретінде 1 мкл қан қолданылды. М: TIANGEN маркері II; 1-3: 3 түрлі қан үлгілері; NTC: праймерсіз басқару. Эксперименттік нәтижелер: Blood Direct ПТР жинағы ұзындығы 4 кб болатын фрагменттерді күшейте алады, бұл оның ұзын фрагменттерді күшейте алатынын көрсетеді.
	Үлгі ретінде адамның EDTA антикоагуляциясын қолдана отырып, қанның әртүрлі үлгілерін ПТР анықтау үшін Blood Direct ПТР жинағы қолданылды. ПТР реакция жүйесі 20 мкл болды, ал үлгі ретінде 1 мкл қан қолданылды. М: TIANGEN маркері II; 1-9: қанның жүктелу мөлшері тиісінше 0,1 мкл, 0,2 мкл, 0,3 мкл, 0,4 мкл, 1 мкл, 2 мкл, 3 мкл, 4 мкл және 5 мкл; NTC: шаблонсыз басқару Эксперименттік нәтижелер: Blood Direct ПТР жинағы қанға күшті қарсылыққа ие және жүктеме диапазоны 0,1-5 мкл болатын қан үлгілерін күшейте алады.
	Үлгі ретінде адамнан, егеуқұйрықтан, тауықтан және басқа да емдік әдістері бар қан үлгілері пайдаланылды. Blood Direct ПТР жинағы PRNP (адам, 750 а.к.), актин (егеуқұйрық, 200 соққы) және β-актинді (тауық, 1,0 кб) күшейту үшін қолданылды. ПТР реакция жүйесі 20 мкл болды, ал үлгі ретінде 1 мкл қан қолданылды. М: TIANGEN маркері II. Экспериментальды нәтижелер: ПТР -дің тікелей жиынтығын көптеген үлгілерге қолдануға болады, ал ПТР -ды тікелей анықтауды әр түрлі емдік әдістері бар қан үлгілеріне жүргізуге болады.

С: Күшейту жолақтары жоқ

A-1 үлгісі

■ Үлгі құрамында ақуыз қоспалары немесе Taq ингибиторлары және т.б. бар - ДНҚ үлгісін тазалаңыз, ақуыз қоспаларын алып тастаңыз немесе тазалау жиынтығымен ДНҚ үлгісін шығарыңыз.

■ Үлгінің денатурациясы толық емес - Денатурация температурасын тиісті түрде арттырыңыз және денатурация уақытын ұзартыңыз.

■ Үлгінің нашарлауы —– Үлгіні қайта дайындаңыз.

А-2 праймері

■ Праймерлердің сапасы нашар-праймерді қайта синтездейді.

■ Праймердің деградациясы - консервілеу үшін жоғары концентрациялы праймерлерді шағын көлемге бөліңіз. Бірнеше рет мұздату мен ерітуді болдырмаңыз немесе 4 ° C температурада ұзақ уақыт сақтаңыз.

■ Праймерлердің дұрыс емес дизайны (мысалы, праймердің ұзындығы жеткіліксіз, праймерлер арасында димер пайда болды және т.

A-3 мг²⁺концентрация

■ Мг²⁺ концентрациясы тым төмен - Мг -ны біртіндеп жоғарылатады²⁺концентрациясы: Mg оңтайландырады²⁺ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация²⁺ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.

A-4 Жылу температурасы

■ Жоғары күйдіру температурасы праймер мен шаблонды байланыстыруға әсер етеді. —— Жылу температурасын төмендетіңіз және 2 ° C градиентімен жағдайды оңтайландырыңыз.

A-5 Ұзарту уақыты

■ Қысқа ұзарту уақыты —— Ұзарту уақытын көбейту.

Q: жалған оң

Құбылыстар: Теріс үлгілер сонымен қатар мақсатты реттілік жолақтарын көрсетеді.

А-1 ПТР ластануы

■ Мақсатты тізбектің немесе күшейту өнімдерінің айқас ластануы - теріс үлгідегі мақсатты тізбегі бар үлгіні пипеткамен немесе центрифугалық түтіктен төгіп алмаңыз. Қолданыстағы нуклеин қышқылдарын жою үшін реагенттерді немесе жабдықты автоклавтау керек, ал ластанудың болуын теріс бақылау эксперименттері арқылы анықтау керек.

■ Реагенттердің ластануы - Реагенттерді бөліп, төмен температурада сақтаңыз.

A-2 Primer

■ Мг²⁺ концентрациясы тым төмен - Мг -ны біртіндеп жоғарылатады²⁺ концентрациясы: Mg оңтайландырады²⁺ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация²⁺ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.

■ Дұрыс емес праймер дизайны және мақсатты тізбектің мақсатсыз реттілікпен гомологиясы бар. —– Қайта жобалау праймері.

Q: спецификалық емес күшейту

Феномендер: ПТР күшейту жолақтары күтілетін мөлшерге сәйкес келмейді, үлкен немесе кіші, немесе кейде спецификалық күшейту жолақтары да, спецификалық емес күшейту жолақтары да кездеседі.

A-1 праймері

■ Праймердің ерекшелігі нашар

—– Қайта жобалау праймері.

■ Праймер концентрациясы тым жоғары —— денатурация температурасын дұрыс жоғарылатыңыз және денатурация уақытын ұзартыңыз.

A-2 мг²⁺ концентрация

■ Мг²⁺ концентрация тым жоғары —— Mg2+ концентрациясын дұрыс төмендетіңіз: Mg оңтайландырыңыз²⁺ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация²⁺ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.

А-3 термостабильді полимераза

■ Ферменттің шамадан тыс мөлшері - - ферменттің мөлшерін сәйкесінше 0,5 U аралықта азайтыңыз.

A-4 Жылу температурасы

■ Күйдіру температурасы тым төмен ——Жылу температурасын дұрыс арттырыңыз немесе екі сатылы күйдіру әдісін қолданыңыз.

А-5 ПТР циклдары

■ ПТР циклдерінің тым көп болуы - ПТР циклдарының санын азайту.

Сұрақ: жағымсыз немесе жағынды жолақтар

A-1 праймері—— Нашар ерекшелігі —— Праймерді қайта жобалаңыз, оның ерекшелігін жақсарту үшін оның орнын және ұзындығын өзгертіңіз; немесе кірістірілген ПТР жасаңыз.

A-2 ДНҚ үлгісі

—– Үлгі таза емес - Үлгіні тазартыңыз немесе ДНҚ -ны тазарту жиынтығымен алыңыз.

A-3 мг²⁺ концентрация

——Мг²⁺ концентрациясы тым жоғары - Mg мөлшерін дұрыс төмендетеді²⁺ концентрациясы: Mg оңтайландырады²⁺ оңтайлы Mg анықтау үшін 0,5 мМ интервалмен 1 мМ -ден 3 мм -ге дейінгі реакциялар сериясымен концентрация²⁺ әр шаблон мен праймер үшін концентрация.

A-4 dNTP

——ДНТП концентрациясы тым жоғары —ДНТП концентрациясын тиісінше төмендетіңіз

A-5 Жану температурасы

——Жою температурасы өте төмен ——Жылу температурасын сәйкесінше арттырыңыз

A-6 циклдары

——Онша цикл - Цикл санын оңтайландырыңыз

Q: 50 мкл ПТР реакция жүйесіне қанша үлгі ДНҚ қосу керек?

Q: Ұзын фрагменттерді қалай күшейтуге болады?

Бірінші қадам - сәйкес полимеразаны таңдау. Тұрақты Taq полимеразасы 3'-5 'экзонуклеаза белсенділігінің болмауына байланысты тексере алмайды, және сәйкес келмеу фрагменттердің кеңею тиімділігін едәуір төмендетеді. Сондықтан тұрақты Taq полимеразасы 5 кб -тан асатын мақсатты фрагменттерді тиімді түрде күшейте алмайды. Арнайы модификациясы бар так полимеразасы немесе басқа жоғары сенімді полимеразаны кеңейту тиімділігін жоғарылату және үзінділерді ұзақ күшейту қажеттіліктерін қанағаттандыру үшін таңдау керек. Сонымен қатар, ұзын фрагменттерді күшейту сонымен қатар праймердің контурын, денатурация уақытын, ұзарту уақытын, рН буферін және т.б. сәйкес реттеуді талап етеді. Әдетте 18-24 а.к. болатын праймерлер өнімділіктің жоғарылауына әкелуі мүмкін. Шаблонның зақымдалуын болдырмау үшін 94 ° С температурадағы денатурация уақытын циклде 30 сек немесе одан да азайтуға болады, ал күшейту алдында температураны 94 ° C дейін көтеру уақыты 1 минуттан аз болуы керек. Сонымен қатар, ұзарту температурасын шамамен 68 ° C деңгейінде орнату және ұзарту уақытын 1 кб/мин жылдамдығына сәйкес жобалау ұзын фрагменттердің тиімді күшейтілуін қамтамасыз ете алады.

Q: ПТР күшейту сенімділігін қалай жақсартуға болады?

ПТР күшейту қателігі әр түрлі ДНҚ полимеразаларын жоғары сенімділікпен төмендетуге болады. Осы уақытқа дейін табылған барлық Taq ДНҚ полимеразаларының ішінде Pfu ферментінің қателігі ең төмен және сенімділігі жоғары (қосымша кестені қараңыз). Ферментті таңдаудан басқа, зерттеушілер реакция жағдайларын оңтайландыру арқылы ПТР мутация жылдамдығын одан әрі төмендете алады, соның ішінде буферлік құрамын, термостабильді полимеразаның концентрациясын және ПТР циклінің санын оңтайландырады.

Хабарыңызды осында жазыңыз және бізге жіберіңіз

Өнімдер санаттары

НЕГЕ БІЗДІ ТАҢДАУ

Біздің фабрика құрылған сәттен бастап принципті сақтай отырып, бірінші әлемдік деңгейдегі өнімдерді шығарады
бірінші кезекте сапа. Біздің өнімдер жаңа және ескі тұтынушылар арасында сенімді беделге ие болды.

СҰРАУ