FastKing RT жиынтығы (gDNase көмегімен)

А-1 РНҚ ыдырайды

—— Ластанбаған жоғары сапалы РНҚ тазартыңыз. РНҚ алынатын материал РНҚ деградациясын болдырмау үшін мүмкіндігінше жаңа болуы керек. RT реакциясы алдында денатурленген гельдегі РНҚ тұтастығын талдаңыз. РНҚ экстракциясынан кейін оны 100% формамидте сақтау керек. Егер RNase ингибиторы қолданылса, қыздыру температурасы <45 ° C, ал рН 8,0 -ден төмен болуы керек, әйтпесе ингибитор барлық байланысқан РНазаны босатады. Сонымен қатар, құрамында 0,0 мм ДТТ бар ерітінділерге РНаза ингибиторын қосу керек.

А-2 РНҚ құрамында кері транскрипция реакцияларының ингибиторлары бар

—— Кері транскрипция ингибиторларына SDS, EDTA, глицерин, натрий пирофосфаты, спермидин, форамид, гуанидин тұзы және т.б жатады. Бақылау РНҚ -сын үлгімен араластырыңыз және ингибитордың бар -жоғын тексеру үшін шығымды басқарушы РНҚ реакциясымен салыстырыңыз. Ингибиторларды кетіру үшін РНҚ тұнбасын 70% (көлемдік көлем) этанолмен жуыңыз.

A-3 ЦДНҚ-ның бірінші тізбегін синтездеу үшін қолданылатын праймерлерді жеткіліксіз күйдіру

——Жылу температурасы экспериментте қолданылатын праймерлерге жарамды екенін анықтаңыз. Кездейсоқ гексамерлер үшін реакция температурасына жеткенге дейін температураны 25 ° C температурада 10 минут ұстау ұсынылады. Гендік праймерлер (GSP) үшін басқа GSP қолданыңыз немесе олиго (dT) немесе кездейсоқ гексамерге ауысыңыз.

A-4 РНҚ-ның аз мөлшері

—— РНҚ мөлшерін көбейтіңіз. РНҚ үлгілері үшін 50 нг аз, 0,1 мкг -ден 0,5 мкг ацетил BSA -ны бірінші тізбекті cDNA синтезінде қолдануға болады.

А-5 Мақсатты реттілік талданатын тіндерде көрсетілмейді.

—— Басқа тіндерді қолданып көріңіз.

А-6 ПТР реакциясы сәтсіз аяқталады

—– Екі сатылы RT-ПТР үшін ПТР қадамындағы cDNA үлгісі реакция көлемінің 1/5 бөлігінен аспауы керек.

A-1 Праймер мен шаблондарды спецификалық емес күйдіру

—— Праймерлердің 3-ұшында 2-3 дГ немесе дК болмауы керек. Кездейсоқ праймерлердің немесе олигоның (dT) орнына бірінші тізбекті синтездеуде Генге тән праймерлерді қолданыңыз. Алғашқы бірнеше циклде жоғары күйдіру температурасын қолданыңыз, содан кейін күйдіру температурасын төмендетіңіз. Реакцияның ерекшелігін жақсарту үшін ПТР үшін ыстық старттық Taq ДНҚ полимеразасын қолданыңыз.

A-2 Гендік спрейлердің нашар дизайны

—— Праймер дизайнын күшейту үшін сол принциптерді орындаңыз.

А-3 РНҚ геномдық ДНҚ-мен ластанған

—— РНҚ-ны ПТР-дәрежелі DNase I. көмегімен емдеңіз, ДНҚ-ның ластануын анықтау үшін кері транскрипциясы жоқ бақылау реакциясын орнатыңыз.

A-4 Праймер димерін қалыптастыру

—– 3 'соңында қосымша тізбектері жоқ праймерлерді жобалау.

A-5 Тым жоғары Mg²⁺ концентрация

Mg оптимизациялау²⁺ әр шаблон мен праймер комбинациясы үшін концентрация

А-6 Шетелдік ДНҚ-мен ластанған

—— Аэрозольге төзімді ұштар мен UDG ферменттерін қолданыңыз.

A-1 Бірінші тізбекті өнімнің мазмұны тым жоғары

—— Кәдімгі ПТР реакция сатысында бірінші жолақты өнімнің мөлшерін азайтыңыз.

А-2 ПТР реакциясында тым жоғары праймер мөлшері

—— Праймер кірісін азайтыңыз.

A-3 Циклдар тым көп

—— ПТР реакция шарттарын оңтайландырыңыз және ПТР циклінің санын азайтыңыз.

A-4 Жылу температурасы өте төмен

—– Спецификалық емес инициация мен созылуды болдырмау үшін күйдіру температурасын жоғарылатыңыз.

A-5 ДНҚ-ның DNase деградациясы нәтижесінде пайда болатын олигонуклеотид фрагменттерінің спецификалық емес күшеюі-ДНҚ-ның ластануын болдырмау үшін жоғары сапалы РНҚ-ны шығарыңыз.

RT-ПТР-бұл РНҚ-ны цДНҚ-ға кері транскрипциялау, содан кейін мақсатты фрагментті күшейту үшін ПТР реакциясының үлгісі ретінде кері транскрипцияланған цДНҚ-ны қолдану. Эксперименттің нақты шарттарына сәйкес кездейсоқ праймерлерді, Oligo dT және гендік спрейлерді таңдаңыз. Жоғарыда аталған барлық праймерлерді қысқышты құрылымсыз эукариотты жасушалық мРНҚ үшін қолдануға болады.

Кездейсоқ праймер: Ұзын РНҚ-ға, сонымен қатар рРНҚ, мРНҚ, тРНҚ сияқты РНҚ-ның барлық түрлеріне сәйкес келеді. Олар негізінен бір үлгідегі РТ-ПТР реакциясы үшін қолданылады.

Oligo dT: PolyA қалдықтары бар РНҚ үшін қолайлы (прокариотты РНҚ, эукариоттық Oligo dT рРНҚ мен тРНҚ -да полиА құйрықтары жоқ). Oligo dT PolyA құйрығына байланғандықтан, РНҚ үлгілерінің сапасы жоғары болуы қажет, тіпті аз мөлшердегі деградация цДНҚ синтезінің көлемін едәуір төмендетеді.

Генге тән праймер: Үлгілер тізбегіне қосымша, мақсатты реттілік белгілі жағдайларға сәйкес келеді.

Екі жол бар:

1. Ішкі анықтамалық әдіс: теорияда cDNA - әр түрлі ұзындықтағы ДНҚ фрагменттері, сондықтан электрофорез нәтижесі жағынды болып табылады. Егер РНҚ молдығы төмен болса, онда электрофорезде ешбір өнім көрсетілмейді, бірақ бұл ПТР көмегімен ешбір өнім күшейтілмейді дегенді білдірмейді. Жалпы, ішкі анықтаманы cDNA анықтау үшін қолдануға болады. Егер ішкі анықтаманың нәтижелері болса, cDNA сапасына негізінен кепілдік беруге болады (кейбір жағдайларда, егер мақсатты ген фрагменті тым ұзын болса, ерекшеліктер болуы мүмкін).

2. Егер осы шаблонмен күшейтілген белгілі ген болса, оны осы геннің праймерлері арқылы тексеруге болады. Ішкі сілтемені күшейту міндетті түрде cDNA -мен проблема жоқ дегенді білдірмейді. Ішкі сілтеме cDNA -да көп болғандықтан, оны күшейту оңай. Егер cDNA әр түрлі себептермен ішінара ыдыраса, ықтималдық тұрғысынан төмен гендік мақсатты гендердің ПТР нәтижелері қатты әсер етеді. Ішкі сілтеме әлі де көп болса да, күшейтуге әсер етпеуі мүмкін.

РНҚ -ның жартылай ыдырауы. РНҚ -ның тұтастығын анықтаңыз және тазартыңыз

Әр түрлі түрдегі РНҚ мазмұны әр түрлі болуы мүмкін, бірақ тұтастай алғанда, шығарылған жалпы РНҚ құрамында гель электрофорезінде 28S және 18S екі анық жолағы болуы керек, ал бұрынғы жолақтың жарықтығы соңғысынан екі есе жоғары болуы керек. 5S диапазоны РНҚ деградацияланғанын көрсетеді, ал оның жарықтығы деградация дәрежесіне пропорционалды. Ішкі сілтеменің сәтті күшеюі РНҚ -мен ешқандай проблема жоқ дегенді білдірмейді, себебі ішкі сілтеме өте көп, деградация қатты болмаса, РНҚ -ны күшейтуге болады. НҚ₂₆₀/ОД₂₈₀Спектрофотометрмен өлшенетін таза РНҚ қатынасы 1,9 мен 2,1 аралығында болуы керек. РНҚ -да ақуыз қоспасының аз мөлшері қатынасты төмендетеді. Егер мән тым төмен болмаса, RT әсер етпейді. RT үшін ең маңыздысы - РНҚ тұтастығы.

Ішкі сілтеме генінің кеңеюі тек RT сәтті болғанын көрсете алады, бірақ бұл міндетті түрде cDNA тізбегінің сапасына байланысты емес. Ішкі сілтеме фрагменттері әдетте көлемі жағынан кіші және өрнегі жоғары болғандықтан, оларға кері транскрипцияда табысты болу оңайырақ. Алайда, мақсатты геннің мөлшері мен экспрессиясы әр генде әр түрлі болады. CDNA сапасын тек ішкі сілтеме бойынша бағалауға болмайды, әсіресе 2 кб -тан асатын мақсатты фрагменттер үшін.

Кейбір үлгілерде күрделі қайталама құрылымдар бар, немесе құрамында ГК көп немесе олар аз мөлшерде бағалы. Бұл жағдайда мақсатты фрагмент пен үлгіге сәйкес сәйкес кері транскриптазаны таңдау керек. Жоғары ГК мазмұны мен күрделі қайталама құрылымы бар РНҚ шаблондары үшін төмен температурада немесе жалпы кері транскриптазасы бар қайталама құрылымды ашу қиын. Бұл үлгілер үшін Quant Reverse Transcriptase таңдалуы мүмкін, себебі оның кері транскрипциясының өнімділігі M-MLV сериялы кері транскриптазаға қарағанда жақсы, ол әр түрлі РНҚ шаблондарын тиімді түрде транскрипциялауға және РНҚ-ны бірінші тізбекке максималды дәрежеде транскрипциялауға мүмкіндік береді. Жалпы кері транскриптаза жинағын қолданған кезде 20 мкл жүйе 1 мкг жалпы РНҚ -ны тиімді түрде кері қайтара алады. Жинақтың RT максималды сыйымдылығына назар аударыңыз. Егер шаблон шамадан тыс қосылса, кері транскрипция РНҚ -ны көп мөлшерде қолдайды. Сондықтан жүйенің максималды сыйымдылығынан аспаған дұрыс.

A-1 РНҚ қатты ыдырайтынын және RT сәтті болғанын анықтаңыз

Жалпы, ішкі анықтамалық күшейтудің сәтсіздігінің себебі көбінесе РНҚ -ның елеулі деградациясынан болады. Басқа ықтимал себеп - кері транскрипцияның бұзылуы. Ішкі анықтаманы cDNA бір тізбегінің сапасын бағалау үшін стандарт ретінде қолдануға болмайды, бірақ егер РНҚ сапасында проблема болмаса, кері транскрипцияның сәтті болғанын анықтау үшін стандарт ретінде қолдануға болады. Кері транскрипция процесінде ең бастысы - реакция тиімділігін жоғарылату үшін тұрақты температура мен тұрақты реакция жүйесін сақтау.

A-2 Ішкі анықтамалық гендерді күшейтуге арналған праймерлердің сенімділігін және ПТР-да қолданылатын реагенттерге қатысты проблемалар бар-жоғын анықтаңыз.

Салыстырмалы мөлшерлеу үшін РНҚ -ны кері транскрипцияға дейін сандық түрде есептеу керек, ол көптеген кері транскрипция жинақтарында қажет, мысалы, РНҚ кірісін 1 мкг мөлшерінде санайды. Кері транскрипцияланған cDNA - бұл РНҚ, олиго dT, фермент, dNTP және тіпті ДНҚ -ның кішкене қалдықтары бар аралас ерітінді болғандықтан, ауытқу пайда болады, сондықтан цДНҚ -ны дәл сандық бағалау мүмкін емес. Сондықтан РНҚ мөлшерін анықтау қажет. Әр түрлі үлгілерде кері транскрипцияның тиімділігі бірдей екенін ескере отырып, алынған цДНҚ мөлшері бірдей болуы керек, ал сандық талдау жалпы гендік РНҚ -ның әр түрлі гендерінің экспрессия деңгейлерінің салыстыруын көрсете алады. Салыстырмалы флуоресцентті сандық ПТР жүргізгенде, кері транскрипциядан кейін сандық цДНҚ қажет болмауы мүмкін, себебі ішкі сілтеме гені сілтеме ретінде әрекет етуі мүмкін.

Бұл негізінен гендерге қатысты, ал ұзын фрагменттің кері транскрипциясы көптеген гендер үшін мүмкін емес. Біріншіден, кері транскрипцияның тиімділігі ПТР -ге қарағанда әлдеқайда төмен. Екіншіден, ГК -ге бай аймақ және көптеген гендердің қайталама құрылымы кері транскрипцияны да, ПТР -ды де шектейді. Ақырында, ПТР сенімділігі мен күшейту тиімділігіне бір уақытта кепілдік беру қиын. Кері транскрипциялау процесінде ешкім көшірмесі төмен гендер үшін, әсіресе олиго dT көмегімен, ұзақ үзінді алуға кепілдік бере алмайды. ГК көп болатын 5 'УТР болсақ, одан да қиын. Сондықтан, кездейсоқ праймерлермен транскрипцияны кері қайтару, мақсатты фрагменттегі табиғи бөліну орындарын табу, сегменттер бойынша күшейту, содан кейін шектеуді сіңіру мен байланыстыруды орындау әлі де ақылға қонымды әдіс болып табылады. Жалпы алғанда, 2 кб -тан асатын фрагменттерді тікелей күшейту қиын, бірақ оны алу әрқашан мүмкін емес: 1. Біріншіден, РНҚ/мРНҚ -ның тұтастығына кепілдік беріледі, ал ТРИЗОЛ экстракциясы қолайлы. 2. M-MLV RT-ПТР жинағын тікелей қолдануға болады. Қуату уақытын ұзартыңыз және күшейту процесінде цикл санын көбейтіңіз. Сонымен қатар, кірістірілген ПТР қолдануға болады немесе фрагменттерді кеңейтуге көмектесетін қалыпты ПТР күшейтуден бұрын денатурация мен ұзарту уақытының сәйкесінше ұзартылуымен бір немесе екі реакцияны жүргізуге болады. Полимеразаның сенімділігіне назар аударыңыз. 3. Long Taq ПТР -де мінсіз нәтиже алу үшін қолданылуы мүмкін. 4. Ақуызды экспрессиялау үшін жоғары сенімді полимеразаны қолдану керек.

TIANGEN ұсынған кері транскриптазаның екі түрі бар: Quant/King RTase және TIANScript M-MLV. Олардың негізгі айырмашылығы - шаблондардың саны. Квант-бұл Moloney murine лейкозы вирусынан алынған жиі қолданылатын M-MLV-ден ерекшеленетін бірегей кері транскриптаз. Quant-бұл ішек таяқшасы инженериясының рекомбинантты түрде көрсететін жоғары тиімділігі жоғары жаңа транскриптазасы. Quant жоғары кері транскрипциялық белсенділігі мен жоғары шығымдылығы бар 50 нг-2 мкг РНҚ-ны күшейтуге жарамды. Кәдімгі MMLV немесе AMV -мен салыстырғанда, Quant -тің ең үлкен ерекшелігі - оның РНҚ шаблондарымен өте тығыз байланысы бар және жоғары температуралы денатурациясыз транскриптті күрделі үлгілерді кері қайтара алады. GC мазмұны жоғары шаблондар үшін кері тиімділік жоғары болады. Алайда, бұл кері транскриптазаның RNase H белсенділігі бар, ол cDNA өнімінің ұзындығына әсер етуі мүмкін (<4,5 кб шаблондар үшін жарамды). Кәдімгі кері транскрипция үшін TIANScript MMLV кері транскриптазасы ұсынылады. Бұл RTase - өте әлсіз RNase H белсенділігі бар модификацияланған фермент, ол ұзақ (> 5 кб) цДНҚ синтезіне жарайды.

Бір сатылы кері транскрипция мен ПТР күшейту сол түтікте cDNA синтезі мен күшейту арасындағы түтік қақпағын ашпай аяқталады, бұл ластануды азайтуға көмектеседі. Барлық алынған cDNA үлгілері күшейту үшін қолданылатындықтан, сезімталдығы жоғары, жалпы РНҚ -ның ең азы 0,01 пг. Бір сатылы RTPCR табысты болу үшін, әдетте, генге тән праймерлер cDNA синтезін бастау үшін қолданылады. Екі сатылы әдіс, яғни кері транскрипция және ПТР күшейту екі сатыда жүзеге асырылады. Біріншіден, кері транскрипция РНҚ үлгісінен cDNA алу үшін жүргізіледі, ал алынған цДНҚ бір немесе бірнеше ПТР реакцияларына ұшырайды. Екі сатылы әдіс cDNA бірінші тізбегінің синтезін жүргізу үшін олиго (dT) немесе кездейсоқ праймерлерді қолдана алады және белгілі бір үлгідегі барлық мРНҚ ақпаратын кері транскрипциялай алады.